SAM-TB(Sequence Analysis of Mycobacterium Tuberculosis)

## FAQ

###关于网站功能

#### 1. 这个网站有什么实用性的功能？能完成哪些事情？

本网站旨在建立了一个界面友好、功能丰富的结核分枝杆菌全基因组测序数据分析平台，支持Illumina平台测序的paired-end数据分析。目前具有以下功能：

（1）测序数据质量控制：对样本的测序质量进行评估，并通过质控改进数据质量；

（2）非结核分枝杆菌（NTM）菌种鉴定：网站根据样本比对到参考序列H37Rv（NC_000962.2）的结果，对基因组比对率≤95%的菌株进行NTM菌种鉴定。若样本属于mlstverse 软件[1]菌种库中175种NTM中的一种，则报告鉴定到的NTM菌种；否则，报告为未知。若检测到样本为MTB和NTM混合样本，则报告MTB及与其混合的NTM菌种。

（3）结核分枝杆菌（MTB）混合感染鉴定：对属于MTB的样本，网站使用Mixinfect[2]软件检测样本是否存在两种或者以上MTB的混合感染。如果混合感染，将报告样本中主要菌株的预估比例。需要注意的是，当样本中次要菌株占比低于10%时，软件检测混合感染的能力可能会降低。

（4）变异检测和注释：若样本含有完整的结核分枝杆菌复合群（MTBC）特有序列（H37Rv 315947- 316534区域），并且基因组平均测序深度≥5，则对样本进行变异检测和注释，提供全基因组变异信息，包括SNPs、短的indels和长的deletion（≥50bp）。

（5）核心基因组多位点序列分型（cgMLST）分析：网站根据已发表的包含2891个核心基因的cgMLST方案[3]来确定MTB菌株的cgMLST等位基因谱。

（6）耐药预测：检测结核分枝杆菌样本对17种抗结核药物（异烟肼、利福平、乙胺丁醇、皮嗪酰胺、链霉素、乙硫异烟胺、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、氧氟沙星、莫西沙星、对氨基水杨酸、环丝氨酸、利奈唑胺、氯法齐明、贝达喹啉、德拉马尼）的分子药敏，提供耐药突变及其频率（可判断是否为异质性耐药），以及注释预测耐药可靠性低的突变（包括可靠性低[4]和可靠性未知的突变）。本网站还可以分析菌株对四种一线药物敏感性（详见帮助中心“一线药物敏感性和耐药性预测“）。

（7）菌株亚型鉴定：对属于结核分枝杆菌复合群（MTBC）的样本，本网站可进行Lineage鉴定（L1-9、M. bovis、M.caprae和 M.orygis）。

（8）菌株间遗传距离分析：网站可以对多个样本进行两两菌株间SNP距离(pairwise SNP distance)分析。

（9）进化树构建：网站可以对多个样本进行进化树构建（基于SNP或cgMLST）。用户可使用figtree, ggtree和iTOL等进化树美化工具将SNP距离小于某个阈值（如12个SNPs）的菌株对应到进化树上，根据它们在进化树上的位置（是否位于同一个clade），可以鉴定成簇菌株。

注意：对于MTB和NTM混合样本，网站会进行变异检测和注释、耐药预测、亚型鉴定分析，但是结果不准确。若选择了不适用于亲缘关系分析的样本计算菌株间SNP距离和构建进化树，可能会影响分析结果。

####2. 我有大量的批测序数据，可以一直使用你们这个网站进行分析吗？

目前每位用户的可分析样本的上限为100。当分析达到上限后，用户可下载分析结果，删除已分析的数据后可再进行分析。若需要提高可分析样本的上限，可发送邮件至samtb2018@163.com申请。

####3. 数据分析完成之后，能否导出分析结果？

网站可以导出分析完成样本的质控结果、耐药结果、耐药突变和变异信息。并且，网站支持批量导出这些分析结果，其中批量导出的变异信息经过整合，列出了每个变异在样本中的分布情况。

###关于输入

####1. 你们的网站对测序数据的格式有要求吗？

目前网站只支持双末端测序(paired-end)数据的分析，并且只支持上传fastq/fastq.gz文件。如果您拿到的测序数据为bam格式，可通过 [bamtofastq](http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/content/tools/bamtofastq.html) 网页的说明进行格式的转化。

####2. 构建进化树有什么要求吗？

构建进化树要求至少有4个样本，最多不超过2000个样本。但是要注意当样本量超过500个时，使用最大似然法构建进化树（基于SNP）会很慢。网站提供了用于构建进化树的fasta文件，用户可以下载后采用其他软件进行进化树构建。此外，网站还提供了基于cgMLST建树功能，该功能能够显著提升建树速度。

###关于网站使用

####1. 网站的具体使用流程是怎样的？

（1）创建账号：进入SAM-TB首页后 ，点击“登录”。在登录页面输入注册邮箱及密码。如果您还未申请账号，可以点击“免费申请试用”，填写简单的信息之后会收到后台发送的邮件，其中包含账号的初始密码。密码可以在设置中修改。

（2）上传数据、创建分析以及查看分析结果请阅读“帮助中心”。

####2. 数据分析过程看起来时间很长，对于我们不做分析的人来说很难把握产生结果的时间，能不能加上一个进度条？

分析过程中会受到集群状态以及系统任务调度等因素的影响，导致即使同样大小的文件的运算时间也会发生变化，因此无法提供进度条。通常一个结核分枝杆菌样本如果开始分析了，20分钟左右能够得到单样本变异检测、耐药、亚型鉴定等结果。

####3. 如果我中途网页不小心关闭，正在运行的分析会不会受到影响？

如果样本已经提交分析了，关闭或刷新网页不会对分析过程造成影响。但是如果在数据上传过程中关闭或者刷新网页，会造成数据上传中断。如果发生错误操作导致数据上传中断，重新上传文件后会从断点续传。批量上传数据时可开其他网页进行搜索和浏览。

####4. 我的数据太多了，每个样本都对应着两个测序文件，难道我只能每次一个一个地把菌株的数据与样本对应链接起来吗？

本网站提供两种方法将数据与对应的样本链接起来：

①本网站在“我的数据”页面“批量操作”栏提供“批量更新Metadata”，点击浮框中的“下载模板”，按要求填写后并上传，即可将数据与样本关联起来。

②本网站在“我的数据”页面下提供“批量创建分析”，按要求创建分析后便可将样本与数据对应起来，并且网站会自动开始分析。

####5. 不小心删除了某一个样本怎么找回？

到“我的样本”中“回收站”选择恢复该样本即可。

####6. 为什么浏览器导不出表格？

浏览器兼容问题。推荐使用谷歌浏览器、Safari浏览器或火狐浏览器。不支持表格导出的浏览器有QQ浏览器等。

###关于网站安全性

####1. 怎么修改密码？

点击右上角“账号设置”，可以修改您的基本信息以及密码。请注意，后台暂时不能查看用户的密码，请自行保存密码。

####2. 忘记密码怎么办？

在登录页面点击“忘记密码”。在浮框中输入你的注册邮箱，点击“找回密码”，跳转到新页面后填写您在注册账号时填写的邮箱即会收到一封邮件，按照邮件的提示即可重新填写密码。

####3. 我上传都是未发表的测序数据，你们的网站有可能会泄密吗？

关于信息安全问题，用户可以完全不用担心。在注册账号时我们提供了比较详细的“用户协议”，包括“使用规则”、“用户信息保护”、“风险提示”、 “免责声明”等内容。在进行分析时，您完全可以不用填写病人的任何信息，只需要填写您自己可以清楚分辨且不重复的样本名。

###关于分析结果

####1. 数据质量控制的每一项代表什么意思？如果质控不通过的话，后面的分析结果就完全不能参考了吗？

（1）数据质量控制的具体含义可参考：[用FastQC检查高通量测序原始数据的质量](https://www.cnblogs.com/longjianggu/p/5078782.html)

（2）网站“数据质控”页根据基因组平均深度和10X coverage判断数据质量是否满足耐药性和敏感性预测。对于质控通过的样本如果多个其他质控项结果为“差”，可能也会影响药物敏感性预测结果。

（3）质控不通过的样本，如果基因组平均深度≥20（或比20稍低），并且10X coverage≥ 97%（或比97%稍低），变异检测结果可以参考，但是耐药性和敏感性预测结果可能会受影响。

####2. 为什么网站上有些变异在ref列没有给出具体的序列，中间用…表示，如C...T1358del？

网站中对大于50bp的deletion省略了其在参考基因组上的具体序列，而注释成该deletion的“起始碱基””…””末位碱基“”deletion长度“”del“。如C...T1358del表示这个deletion最开始的碱基是C，最后的碱基是T，是一个长度为1358bp的deletion。如果大于50bp的deletion跨了整个基因或多个基因或跨基因和基因间区，则”基因位置“列注释为该deletion在染色体上的位置，如Chromosome:1541947_1543304，”基因名“和”基因标签“列注释出其涉及的所有基因或者基因间区，如：Rv1369c,Rv1370c,lprF-Rv1369c,Rv1370c-Rv1371。

####3. 我想要知道样本在某个基因上的所有突变，如katG基因上的所有突变；或者某种特定类型的突变，如所有非同义突变，网站可以实现吗？

可以。在我的分析页面点击“分析编号”进入“分析首页“，然后切换至”变异信息“页面。该页面提供了变异的搜索及筛选。

①在页面右上角的搜索框中输入基因名称，即可查看样本在该基因上的所有突变。如输入katG则可查看katG基因上的所有突变（如果该基因上有突变）。

②点击页面右侧的筛选标志，还可以依据基因组位置、基因标签、变异类型等进行变异筛选。网站的变异类型注释有以下11种：Delete、Delete\_frameshift、Delete\_non\_frameshift、Delete\_SV（结构变异，这里指≥50bp的deletion）、Insert、Insert\_frameshift、Insert\_non\_frameshift、Intergenic、Nonsynonymous、Small RNA、Synonymous。其中，基因间区的indel注释为Delete或Insert，基因上的indel注释为Delete\_frameshift、Delete\_non\_frameshift、Insert\_frameshift或Insert\_non\_frameshift，跨了整个基因或多个基因或跨基因和基因间区的deletion注释为Delete\_SV。在“变异类型”栏输入某种变异类型，将会得到基因组上所有该类型的变异，如中输入Nonsynonymous，可得到该样本所有非同义突变。

####4. 为什么有些耐药突变，在“变异信息”页搜不到？

为检测样本是否存在异质性耐药，网站对检测到的频率≥10%的耐药突变都进行报告，但在“变异信息“页只报告频率≥75%的固定突变。

####5. 网站中批量导出的变异信息，有什么用？

本网站提供了多个样本变异信息的批量导出。这是经过整合的结果，依据用户给的分析或样本列表，将这些样本的所有变异整整合到一起，每一行代表一个变异，前12列表示变异信息，第13列表示有多少个样本有该变异，后面的列是有该变异的样本，及变异位点的mapping结果。

基于这个结果，用户可以查看某个或某些变异在样本中的分布情况，与样本表型结合进行特异性分析。

####6. 进化树文件如何使用？

从网站下载的进化树文件是.nwk格式（一种把进化树转化为各分支节点的文本格式，不是进化树的图），本质是文本文件，用户可以自行用记事本查看。

访问“MEGA”官网，下载并安装合适版本的MEGA 7/10。打开MEGA 7/10 ，左上角“file” 中的“Open A File”，选择nwk文件就可以生产一棵进化树，与网站形成的进化树一致。MEGA还具有很多功能，用户可查看官网说明。还有一些其他像figtree软件，ggtree、iTOL网站，都是很好的进化树展示和美化工具。

####7. 为什么“菌株SNP距离”分析结果包含不同Lineage的菌株成簇的现象？

一般情况下是因为样本菌株存在混合感染的情况。可以先在“单样本变异检测”中查看质量控制是否通过，并查看突变数量是否与其他菌株相差很多。由于同一个亚型的菌株通常积累了相似数量的SNPs，故在统计菌株SNP时，SNP异常少或者异常多的菌株（即离群值）通常是有问题的，在分析中可以排除。这种情况可能是测序错误，也可能是DNA本身就存在污染。

###参考文献

[1] Yuki Matsumoto, Takeshi Kinjo, Daisuke Motooka, Daijiro Nabeya, Nicolas Jung, Kohei Uechi, Toshihiro Horii, Tetsuya Iida, Jiro Fujita & Shota Nakamura. Comprehensive subspecies identification of 175 nontuberculous mycobacteria species based on 7547 genomic profiles. Emerging Microbes & Infections. 2019;8(1):1043-1053. doi: 10.1080/22221751.2019.1637702. PubMed PMID: 31287781; PubMed Central PMCID: PMC6691804.

[2] Sobkowiak, B., Glynn, J.R., Houben, R.M.G.J. et al. Identifying mixed Mycobacterium tuberculosis infections from whole genome sequence data. BMC Genomics 19, 613 (2018). https://doi.org/10.1186/s12864-018-4988-z

[3] Kohl TA, Harmsen D, Rothgänger J, Walker T, Diel R, Niemann S (2018) Harmonized genome wide typing of tubercle bacilli using a web-based gene-by-gene nomenclature system. EBioMedicine 34:131–138. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2018.07.030

[4] Paolo Miotto, Belay Tessema, Elisa Tagliani, Leonid Chindelevitch, Angela M Starks, Claudia Emerson, Debra Hanna, Peter S Kim, Richard Liwski, Matteo Zignol, Christopher Gilpin, Stefan Niemann, Claudia M Denkinger, Joy Fleming, Robin M Warren, Derrick Crook, James Posey, Sebastien Gagneux, Sven Hoffner, Camilla Rodrigues, Iñaki Comas, David M Engelthaler, Megan Murray, David Alland, Leen Rigouts, Christoph Lange, Keertan Dheda, Rumina Hasan, Uma Devi K Ranganathan, Ruth McNerney, Matthew Ezewudo, Daniela M Cirillo, Marco Schito, Claudio U Köser, Timothy C Rodwell. A standardised method for interpreting the association between mutations and phenotypic drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. European Respiratory Journal. 2017;50(6):1701354. doi: 10.1183/13993003.01354-2017. PubMed PMID: 29284687; PubMed Central PMCID: PMC5898944.